Vitrificación de espermatozoides: una alternativa a la inyección intracitoplasmática de espermatozoides en pacientes con oligoastenozoospermia severa

¿Qué es la Vitrificación de espermatozoides? 

La vitrificación de espermatozoides es un método de criopreservación ultra rápida que consiste en la exposición directa a nitrógeno líquido. De este modo, se evita la cristalización del agua intracelular y el criodaño, sin emplear crioprotectores permeables que pueden implicar riesgo mutagénico.

Se realiza en espermatozoides obtenidos por métodos de selección espermática, lo que garantiza una alta motilidad, y al estar desprovistos de plasma seminal, disminuye el riesgo de transmisión de infecciones virales y bacterianas.

Por tanto, los objetivos del presente trabajo de revisión son: en primer lugar, comparar los resultados de esta técnica sobre los parámetros espermáticos respecto a la congelación convencional (motilidad, viabilidad, integridad acrosómica, integridad de membrana plasmática, fragmentación de ADN, criocapacitación y potencial de membrana mitocondrial) y, en segundo lugar, establecer un protocolo detallado del proceso. Para ello, nos enfocaremos en el fundamento de cada uno de los pasos (empleo de medios y efecto de la temperatura), así como en los casos clínicos que confirman el éxito de esta técnica.

Obtención de muestras. 

Se emplearon 10 muestras de líquido seminal obtenidas por masturbación de donantes normales, con abstinencia mínima de 2 días. Las muestras se mantuvieron a 37 C en estufa de cultivo durante 30-60 minutos hasta su licuefacción. Posteriormente, se realizó un espermiograma y a aquellas muestras consideradas normales según la OMS (WHO, 2010), fueron utilizadas para el protocolo de evaluación de la función espermática.

Desvitrificación.

En tubos Falcon conteniendo 5 ml de HTF-BSA 1% a 37C, se depositaron de a una las esferas de material congelado, agitando con vortex el tubo cada vez que una esfera era depositada dentro de éste. Se desvitrificaron no más de 5 esferas por tubo para evitar el enfriamiento del medio. Luego se equilibró la solución conteniendo los espermatozoides por 5 minutos a 37C en estufa de cultivo y se centrifugó por 5 minutos a 1800 rpm. El pellet fue resuspendido en 0,2 ml de HTF-BSA 1%.

Swim-up.

Los espermatozoides fueron separados del líquido seminal por swim- up. Para ello, se procedió a lavar la muestra disponiendo alícuotas de 600 µl de semen en tubos Falcon. A cada tubo con la muestra se añadieron 5 ml de Human Tubal Fluid (HTF) (Quinn et al., 1985) y se centrifugaron a 400 g por 5 min. Para la selección de los espermatozoides, se adicionó lentamente al pellet, HTF suplementado con HSA (Albúmina Sérica Humana) al 1% y se incubó al menos 45 minutos a 37 °C. Finalmente, se procedió a retirar cuidadosamente el sobrenadante depositándolo en un tubo Falcon estéril.

Vitrificación y desvitrificación de las muestras.

La suspensión espermática con los espermatozoides seleccionados fue dividida en dos fracciones, una de ellas fue sometida a vitrificación, mientras que la segunda permaneció sin vitrificar (control).

Vitrificación.

Una fracción de los espermatozoides seleccionados por swim- up fue vitrificada, para lo cual, en un tubo Eppendorf se depositaron 600 µL de HTF con 1% HSA conteniendo aproximadamente 8×106 espermatozoides/mL. Posteriormente se adicionaron 600 µL sucrosa 0.5 M en HTF y se dejó equilibrar la solución durante 5 min, con una concentración final de sucrosa 0.25 M. Se tomaron alícuotas de 30 µL de suspensión espermática y fueron agregadas directamente en nitrógeno líquido formándose esferas sólidas. Las esferas congeladas fueron depositadas en criotubos rotulados y almacenadas por al menos 24 horas a 196C.